Helicobacteerilajien havaitsemiseen kehitetty tekniikka (2004) . Yhteyksiä maksa ja haimatauteihin havaittavissa. (Väitöskirja )

NILSSON Hans-Olof . Enteric Helicobacter and H.pylori in chronic inflammation and cancer of the hepatobiliary tract and pancreas. Lund University 2004.

 ISBN 91-628-6254-5.http://lup.lub.lu.se/record/467310

TIIVISTELMÄ:

TAUSTA: Helikobakteerisuku koostuu ainakin 26 lajista vuoden 2004 aikoihin ja uusia  lajeja oli arviossa. H.pylori  bakteeri vaikuttaa ihmisten terveyteen,, muta sen lisäksi on  runsasta tutkimusta kohdistettu muihinkin helikobakteerilajeihin, joita on ihmisistä ja eläimistä eristettyja joilla on merkitystä luonnollisissa taudeissa  subkliinisistä tulehduksista  gastrointestinaaliseen ja hepatobiliaariseen  syöpään asti. 

 

TARKOITUS: Tämän työn tarkoituksena  on ollut tutkia, esiintyykö ja  ihmisen maksassa ja sappitiepuustossa  mahalaukun H. pylori ja suoliston helikobakteerilajeja ja ovatko ne havaittavissa ja mikä on mahdollinen assosiaatio näitten mikrobien ja  ihmisen maksa ja haimasairauksien kesken. 

 

MENETELMÄ: Monet helikobakteerilajit ovat hyvin  vaikeita viljellä biologisista näytteistä. Sentakia asetettiin etusijalle PCR- havaitsemismetodit. PCR- metodiin ja nukleiinihappoihin perustuvat analyysit helikobakteerin havaitsemiseksi tuoreista tai formaliinilla fiksoiduista paraffiiniin upottamalla säilötyistä  ihmiskudosnäyteistä optimoitiin. Kehiteltiin eräs tekniikka (multiplex PCR-denaturating gradient gel/DNA sequencing tehnique) jolla pystytään tunnistamaan monia vaikeasti viljeltäviä tai ei-viljeltävissä olevia  mahalaukun ja suolen helikobakteereita ja menetelmä arvioitiin  laboratoriokoe-eläimillä  mahasuolikudoksista  ja erilaisin helikobakterilaaduin.

TULOKSET: Helikobakteerilajien DNA maksansiiräännäisnäytteistä (PSC, PBC , NCLC potilailta) sekä normaalista maksasta korreloivat vahvasti  krooniseen kolestaattisen maksatautiin. H-pylori ja Helicobacter lajien "maksaan" korreloivien geenien sekvenssejä havaittiin maksakudoksista niiltä potilailta, joilla oli maksasolu - ja sappitiehytkarsinooma,  kun taas maksakudokset  paksu ja peräsuolisyöpäpotilaiden  maksamestastaasien  leikkeistä löydökset olivat negatiiviset.

Lapset, joilla oli diagnosoitu erilaisia kroonisia maksatauteja, maksan toksista vauriota ja systeemisiä tauteja, olivat usein positiivisia Helikobakteerisuvulle.  16S rDNA-analyysi osoitti samankaltaisuutta H. pylorilajin ja suoliston H. ganmani lajin kesken. Kroonista maksasairautta potevillla lapsilla diagnosoitiin H. ganmani.

Havaittiin Helikobakteerilajien  liittyvän haimasyöpään, mutta niitä ei ollut havaittavissa  hyvänlaatuisissa haimataudeissa eikä histologissti normaalissa haimassa. 

Odottamaton löydös oli, että  mahalaukun näytteiden PCR-tuotteet  haimasyöpäpotilailta korreloivat  suolen H. bilis, H. hepaticus ja H. ganmani mikrobien sekvensseihin. 

 

YHTEENVETO: Kehitetty PCR-tekniikka jolla löytää  vaikeasti havaittavia helikobakteerilajeja ja  assosiaatioita  helikobakteerilajien ja ihmisen kroonisten maksa- ja haimatautien kesken.

 

Abstract

The Helicobacter genus now consists of at least 26 species, with additional novel species in the process of being validated. Beyond the impact of H. pylori and human health, considerable research has focused on other Helicobacter species isolated from humans and animals and the associated natural diseases that range from subclinical inflammation to cancer in the gastrointestinal and hepatobiliary tract.

 The aims of this study were to investigate whether gastric (H. pylori) and enteric Helicobacter species are present and detectable in the human biliary tree and liver and to explore a possible association between these microbes and human liver and pancreas disease.

 Several Helicobacter species are very difficult to culture from biological samples. Therefore, PCR-based detection methods were preferred. PCR- and nucleic acid-based analyses to detect Helicobacter in fresh as well as formalin-fixed paraffin embedded preserved human tissue specimen were optimised.

 A multiplex PCR-denaturating gradient gel/DNA-sequencing technique that allows identification of many fastidious and non-culturable gastric and enteric Helicobacter was developed and evaluated on gastrointestinal tissue of laboratory rodents, colonised by various Helicobacter species.

 The presence of Helicobacter species DNA in liver transplant specimen of patients with PSC, PBC, NCLC, and normal liver correlated strongly to chronic cholestatic liver disease. H. pylori and Helicobacter sp. ‘liver’-related gene sequences were also detected in liver tissue from patients with hepatocellular- and cholangiocarcinoma, whereas liver tissue from patients with resected liver metastases from colorectal cancers were negative. 

Children diagnosed with various chronic liver diseases, liver toxicity damage and systemic diseases were frequently positive for the genus Helicobacter. 16S rDNA analyses showed similarity to H. pylori and the enteric species H. ganmani. H. ganmani was detected in children with chronic liver diseases.

 Helicobacter species were found to be associated with pancreatic cancer, but was not detectable in samples of benign pancreatic diseases and histologically normal pancreas. Unexpectedly, PCR products from stomach specimen of pancreatic cancer patients were related to sequences of enteric H. bilis, H. hepaticus, and H. ganmani.

 In summary, this thesis explores PCR-based methodology to detect fastidious Helicobacter species and the association between Helicobacter species and human chronic liver and pancreatic diseases. 

Väitöskirja( 2007): Staphylococcus aureus, septinen artriitti, Stafylokokin proteaasit Aur, Ssp,SspB. Ihmisen MMP-9

Väitöskirja  vuodelta  2007: hdl.handle.net/2077/2584

LÄHDE:

Ann-Marie Calander. Proteases in Staphylococcal Arthritis.

Dep. of Rheumatology and inflammation Research. Sahlgrenska Academy, Göteborg university.  ISBN 978-91-628-7040-9

 Tiivistelmästä suomennosta

•  Staphylococcus aureus on yleinen bakteeri. Koska  immuunivajetilat maailman väestössä lisääntyvät samoin kuin antibioottiresistenttien kantojenkin ilmentymä,  on kautta maailman alkanut esiintyä S. aureus - septikemiaa (verenmyrkytystä) ja sen komplikaatioita kuten  niistä aiheutuvaa kuolleisuutta.

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a ubiquitous bacterium. Due to an increasing prevalence of immunodeficiency states in the world population and the emergence of antibiotic resistant strains, the incidence of S. aureus septicaemia and its complications is increasing worldwide, as is the mortality thereof.

•  S.aureus omaa huomattavan  kyvyn  sopeutua ympäristöön, sillä se on kehittänyt  suuren joukon invasiivisia ja evasiivisia mekanismejä  pärjäilemään isäntäkehon immuunipuolustuksen kanssa.  On suoritettu monia kartoittavia  tutkimuksia S. aureuksen virulenssin  determinanteista tarkoituksena parantaa   S. aureus-infektioitten torjumiskykyä. Mutta S. aureuksen  extrasellulaaristen proteaasien osuudesta virulenssissa  ei ennen tätä väitöskirjaa ollut paljoakaan tietämystä.

 S. aureus has an impressive capacity to adjust to the environment since it has developed a multitude of invasive and evasive mechanisms to cope with host defence. Many studies have been performed mapping S. aureus virulence determinants with the aim of improving our ability to combat S. aureus infections. So far, little is known concerning the impact of S. aureus extracellular proteases on virulence.

•  Väitöstyön ensimmäisen osan tarkoituksena oli tutkia bakteeriperäisten extrasellulaaristen proteaasien mahdollista osuutta  S. aureuksen  indusoimassa septisessä artriitissa (niveltulehduksessa).   Luonnollisesti tähän  aihepiiriin kuuluu selvittää, onko spesifistä immuunivastetta S.aureuksen extrasellulaarisiin proteaaseihin  ja jos on, olisiko  proteaasispesifisillä vasta-aineilla jotain estävää funktiota proteaasin aktiivisuuteen ja siten bakteerin  biologisten ominaisuuksien modulaatioon.

 The aim of the first part of this thesis was to investigate the role of bacterial extracellular proteases as potential virulence factors in S. aureus induced septic arthritis. Inherent to this goal was to investigate whether there is a specific immune response to S. aureus extracellular proteases and if so, whether protease specific antibodies have any inhibitory function on the protease activity and thereby modulating the biological properties of the bacteria. 

• Väitöstyön toisessa osassa on ollut tarkoituksena  luoda valoa isäntäkehoproteaasin, matrixmetalloproteinaasin numero 9 (MMP-9) osuuteen   septisessä artriitissa. Vertailtiin kahta  S.aureus-kantaa niiden kyvyssä aiheuttaa niveltulehdusta ja  esiintyä  pinttyneenä munuaisissa ja nivelissä. Toinen kanta oli  S.aur 8325-4, jonka tiedetään  tuottavan runsaasti extrasellulaarisia proteaaseja ja toinen kanta oli sen mutantti, jolta extrasellulaarit proteaasit puuttuvat: Aur-,Ssp- ja SspB-,

The second part of this thesis aimed at shedding light on the impact of a host protease, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) on the development of septic arthritis. S. aureus strain 8325-4 with a known high production of extracellular proteases and its mutants lacking extracellular proteases, Aur-, Ssp- and SspB- were compared concerning their capacity to induce arthritis and to prevail in kidneys and joints. 

• Mitattiin seerumin kokonaisimmunoglobuliinipitoisuudet IgG ja IgM sekä vasta-aineet, jotka olivat spesifiset deletoiduille proteaaseille. Kun hiljennettiin  ssp-, aur- tai sspB- geenit, ei saatu esiin mitään vaikutusta septisen artriitin  kliiniseen tai histologiseen kulkuun. 

Total serum levels of IgG and IgM were measured, as were antibodies specific for the deleted proteases. Silencing of the ssp, aur, or sspB genes did not affect the clinical nor the histological course of septic arthritis. 

•  Polyklonaalinen B-soluaktivaatio saatiin kuvatuksi  auto-vasta-aineitten tuotannosta ja kokonais-IgG immunoglobuliinin kymmenkertaisesta lisääntymästä ja  50-prosenttisesta kokonais IgM immunoglobuliinin lisääntymästä. Spesifinen vasta-ainetuotantovaste pystyttiin osoitamaan,  sillä vain ne hiiret, jotka oli infektoitu SspH - ja V8 - geenejä ilmentävillä bakteereilla antoivat vasteena antiproteaasispesifistä vasta-ainetuotantoa.   Spesifisten vasta-aineiden funktionaalinen kapasiteetti osoitettiin siitä faktasta,  että V8-proteaasin vasta-aineet estivät entyymin  koeputkiolosuhteissa

Polyclonal B-cell activation was illustrated by auto-antibody production and a 10-fold increase in total IgG and a 50% increase in total IgM. Specific antibody response was demonstrated since only mice infected with bacteria expressing SspB and V8 responded with anti-protease specific antibody production. Functional capacity of the specific antibodies was illustrated by the fact that the V8 protease antibodies inhibited the activity of the enzyme in vitro.

•  Isäntäkehon MMP-9- proteaasin tutkimiseksi ajan funktiona suoritettiin zymograafisia analyysejä pernahomogenaateista eri ajankohtina bakteeri-inokulaation jälkeen.  Yhdeksäntenä päivänä inokulaatiosta oli MMP-9  nelinkertaisesti lisääntynyt. Sen osuutta infektiivisessä niveltulehduksessa  selvitettiin edelleen poistogeenisellä hiirellä ja kontrolleilla, sen  ikätoveripesueella: näille  inokuloitiin i.v. S. aureusta. Ne hiiret, joilta puuttui  MMP-9- geeni ilmensivät enemmän kliinistä artriittia ja voivat huonommin. Tärkeä havainto oli, että  MMP-9- poistogeenisen hiiren munuaisissa ja nivelissä  oli merkitsevästi enemmän  bakteereja kuin  saman pesueen muilla, kontrollihiirillä. Tämä viittaa siihen, että  matrixmetalloproteinaasi MMP-9  on välttämätön molekyyli infektoivan aineksen poistamisessa.

 To study the production of host protease MMP-9 over time, zymographic analyses were performed of spleen homogenates at different time points after bacterial inoculation. At day 9 after inoculation there was a four-fold increase of MMP-9 expression. To further investigate the role of MMP-9 in infectious arthritis, MMP-9 KO mice and their littermates C57Bl/6 wt mice, were inoculated i.v. with S. aureus. MMP-9 deficient mice showed more clinical arthritis and thrived less well. Importantly, the MMP-9 KO mice harboured significantly more bacteria in kidneys and joints than did their congenic controls, indicating MMP-9 as an indispensable molecule in the clearance of the infective agent. 

• Kaikenkaikkiaan tässä väitöstyössä osoitettiin, että S. aureus-proteaasit voivat  herättää isäntäkehossa spesifisen immuunivasteen, mutta ne eivät ole  välttämättömiä bakteeriniveltulehduksen välittäjinä. Lisäksi osoitettiin, että isäntäkehon MMP-9 matrixmetalloproteinaasi antaa oman osansa luonnollisen immuunipuolustuksen vasterseen  septisen artriitin aikana.

Altogether this thesis shows that S. aureus proteases can evoke a specific immune response in the host, but that they are not essential in mediating bacterial arthritis. Furthermore, host MMP-9 contributes to innate immune responses during septic arthritis. 

Avainsanat: Keywords: 

Staphylococcus aureus, bakteeri

septic arthritis, septinen niveltulehdus

proteases, proteiinia pilkkova entsyymi

matrix metalloproteinases, MMP entsyymit, sijaitsevat matrixissa ja pilkkovat solun extracellulaarista (ECM)  rakennemateriaalia 

Suomennos 26.11. 2014 

Uudesta kolerarokotekannasta väitöskirja

Stefan Karlsson. Development of novel vaccine strains of Vibrio cholerae and studies on the role of serotype in epidemic spread of cholera.  17.10.2014.
ISBN 978-91-628-9122-0
Dokumentti on  saatavissa internetistä osoitteella  https://gupea.ub.gu.se/handle/2077/35959

Tiivistelmästä suomennosta  (ennen  väitöstilaisuutta). 

KOLERA-tautia aiheuttaa bakteeri Vibrio Cholerae O1 ja se on vaikea ripulitauti, johon sairastuu arviolta 3- 5 miljoonaa ihmistä vuosittain. Se aiheuttaa  140 000 kuolemaa  vuosittain.  Erityisesti  tauti  on paha alle 5- vuotiailla.

 KOLERAA  voi esiintyä kaikkialla maailmassa ja usein  sellaisissa paikoissa, missä puhtaan veden saanti tai  hygieniset olot ovat kyseenalaisia. On tyypillistä, että KOLERA   seuraa luonnonkatastrofien  kintereillä tai ihmisistä johtuvissa katastrofeissa, mutta sitä on myös endeemisenä monissa maissa kuten Intiassa ja Bangladeshissä.

Nykyvaiheessa on  saatavilla kaksi pätevää  KOLERA-rokotetta yli 60 maassa.  Vaikkakin nämä rokotteet ovat tehokkaita, ne ovat kuitenkin  kalliita ja  monimutkaisia valmistaa ja siksi koetetaan  luoda uutta ja  ekonomisempaa KOLERA-rokotetta.

Ensiksikin tässä väitöstyössä on  osoitettu, että on mahdollista  geenimanipulaatiolla luoda yksikantainen rokote, joka ilmentää kahta  ilmiasultaan erilaista fenotyyppiä sekä osoitettu, että kandidaattirokotekannat  saavat aikaan  samanlaisia immuunivasteita kuin nykyinen lisensöity Dukoral-rokote.  Tästä on suurta hyötyä, koska  valmistusprosessi merkitsevästi yksinkertaistuu ja  tuotantokustannukset  alenevat.

Edelleen työssä tutkittiin  luonnossa ilmeneviä  Inaba serotyyppimutantteja ja kehiteltiin hypoteesi siitä,  kuinka  Vibrio cholerae  O1 seroryhmä  pitää yllä  serotyyppipolymorfiaa. Työryhmä  suoritti ainutlaatuisen  tutkimuksen , missä osoitettiin  miljöössä  kiertävien kantojen  valintaaineen miltei varmasti  olevan se voima, joka ylläpitää serotyyppien muuntumista.

Yhteenvetona  väitöskirjan  tulokset osoittavat, kuinka  biologisen tiedon hyödyntämistä  voidaan  soveltaa  kohdegeenien  ja jopa spesifisten   aminohappojen mutatoimiseen  rokotekannan fenotyypin muokkaamiseksi  ja jotta  saataisiin  lisätietoa serotyypin  ainutlaatuisesta ja perustavasta osuudesta  epidemisessä ja endeemisessä KOLERASSA:
Avainsanoja :
Cholera, Vibrio cholerae, Serotype, Ogawa, Inaba, Hikojima,
Vaccine, Immunogenicity,
 serotype switching, wbeT

Väitöskirjan osatöistä  on  aiemmin julkaistu   osa I ja II.Osia on 4.

Ne ovat:
I
Michael Lebens, Stefan L. Karlsson, Susanne Källgård, Margareta Blomqvist, Annelie Ekman, erik Nygren, Jan Holmgren. Construction of Novel Vaccine Strains of Vibrio Cholerae Co-expressing the Inaba and Ogawa Serotype Antigens.  Vaccine, 2011.
II
Stefan L. Karlsson, Elisabeth Ax, Erik Nygren, Susanne Källgård, Margareta Blomqvist, Annelie Ekman, John  Benktander, Jan Holmgfren, Michael Lebens.  Development of Stable Vibrio Cholerae O1 Hikojima Type Vaccine Strains Co-expressing the Inaba and Ogawa  Lipopolysaccharide Antigens.
Published in PLoS ONE 2014-09-28.
III
Stefan L. Karlsson, Nicholas Thomson, Ankur Mutreja, Thomas Connor, Dipika Sur, Mohammad Ali, John Clemens, Gordon Dougan, Jan Holmgren, Michael Lebens. The evolution of O1 Vibrio cholerae during annual cholera outbreaks in an endemic setting.
 ( Submitted)
IV
Stefan L. Karlsson, Michael Lebens. Non-random distribution of mutations leading to the Inaba serotype in O1 Vibrio cholerae from the  El Tor Lineage of 7th  pandemic.  ( Manuscript).