Immuunipuolustus mikrobeita vastaan, antimikrobit peptidit. Väitöskirja 2005

Thesis, väitöskirja

LÄHDE: Tollin Maria. Antimicrobial peptides and proteins in innate immunity. Emphasis on isolation, characterization and gene regulation. Stockholm, 2005, Karolinska Institutet.                                   ISBN 91-7140-270-5.

Abtraktin suomennosta 9.11. 2005.yksityiskohtia johdannostakin.

 Luonnollinen immuniteetti ja sen peptideitä: Defensiinit ja katelisidiinit

“Luonnollisen immuniteetin endogeenisiä antibiootteja ja vaikuttajamolekyylejä ovat antimikrobiaaliset peptidit. Niitä sijaitsee pääasiassa pitkin epiteelejä ja kiertävissä neutrofiileissä. Ne tuhoavat mikrobeja niiden kalvoja rikkomalla. Kaksi pääperhettä nisäkäslajien  antimikrobiaalisia peptidejä ovat defensiinit ja cathelicidiinit. Tässä väitöskirjassa keskitytään tarkastelemaan  ihmisen paksunsuolen limakalvoa ja vernix caseosa-kerrosta. Lisäksi tutkittiin ihmisen cathelicidiini LL-37 geenin säätelyä paksunsuolen epiteelisolulinjassa. Kehitettiin myös koe-eläinmalli cathelicidiinitutkimuksiin.

 Löytö: Ubikvisidiini

Ihmisen paksusuolen limakalvosta valmistettiin peptidi/proteiiniuute ja havaittiin sillä olevan antibakteriaalista ominaisuutta Gram-positiivisia ja -negatiivisia bakteereja kohtaan. Se oli lisäksi antifungaalinen, sienten kasvua estävä. Tästä uutteesta löydettiin useita antimikrobiaalisia peptideitä ja proteiineja.Yksi niistä oli  ubikvisidiini (ubiquicidin), jota ei ole aiemmin eristetty ihmiskudoksista. Näytti siltä että paksusuolta suojaa antimikrobiaalisten peptidien ja proteiinien  kompleksinen seos ja yhdessä niillä on vahva antimikrobiaalinen aktiviteetti.

 Vernix sikiön ihon suojana

Vernix on kermaisata vaha-ainesta, joka suojaa sikiön ihoa viimeisen raskauskolmanneksen aikana. Vernix-aineesta on eristettävissä runsas joukko antimikrobiaaleja peptidejä, proteiineja ja lipidejä. Mielenkiintoista oli havaita, että miltei kaikki vernixissä runsaasti esiintyneet proteiinit kuuluivat ihmisen luonnollisen immuunipuolustuksen tunnettujen  proteiinien joukkoon. Näin vernix muodostaa   tehokkaalla tavalla ihon   puolustuksellisen barrikadin suojaten sikiötä ja vastasyntynyttä bakteereilta, sieniltä ja loisilta. Sen lisäksi vernix-komponenteilla on proteaasi-inhibiittorivaikutusta ja opsonisoivia piirteitä.

Tutkimusmenetelmä

Koe-eläinkannalta (rotta)  eristettiin cathelicidiiniä vastaava peptidi  (rCRAMP) ja todettiin sen olevan 43 aminohappotähteinen.  Mutta toisella lähisukuisella eläinkannalla (hiiri) peptidi prosessoitui jo eri tavalla, vaikka prosessoituvien kohtien primäärirakenteet olivat samanlaisia. Kuitenkin  rCRAMP oli yhtä lailla antimikrobiaalinen ja expressioltaan samanlainen kuin  ihmisenkin cathelicidiini (LL-37).  Sen takia katsottiin  koe-eläimellä voitavan  analogisesti tutkia sairauden ja terveyden vaikutusta cathelicidiinin expressioon

 Luciferaasi reportterigeenisysteemi, Ets, D-vitamiini,

Ihmisen paksunsuolen epiteelisen solulinjan LL-37- geenisäätö tutkittiin (Luciferase reporter system). Promoottorissa  löydettiin ainakin yksi kiihdyttävä ja kaksi hiljentävää elementtiä. Kiihdyttävän elementin osoitettiin olevan Ets-sitova kohta ja toinen hiljentävistä elementeistä säätyi D-vitamiinin avulla. Lisäksi havaittiin toisen intronin kiihdyttävän transkriptionaalista aktiviteettia voihapon (Butyric acid C4:0) läsnäollessa ja promoottorin 3´-päädyn kanssa  ko-operaatiossa. LL-37-geeniregulaatio on alkamassa selvitä.”

Taustatekijöissä on olennaista lähdetietoa mistä lyhennelmää:

 Kirjoittaja  kuvaa immuniteettijärjestelmän,  sekä adaptiivisen että luonnollisen immuniteetin periaatteet.

Soluspesifisen adaptatiivisen (tilanteeseen spesifisti räätälöidyn) immuunipuolustuksen heikkous on sen hitaus

Adaptatiivinen järjestelmä  toimii antigeenin  täsmällisellä tunnistuksella ja analyysillä sekä  spesifisten  vasta-aineiden muodostuksella ( T ja B-solurepertuaari). Adaptatiivisesta puolesta tutkija  mainitsi, että mikrobin eliminaatioon kuluu täyden adaptiivisen immuniteetin (lymfosyytien, imusolujen täyden järjestelmän)  voimien ollessa koottuna n.  4-5 päivää, kun taas sinä aikana bakteeri voi kaksinkertaistaa määränsä joka 20 minuutti. Sellainen inhiboimaton bakteerikasvu voisi teoreettisesti ottaen johtaa ihmisen puolustussolujoukon supistumiseen kymmenestä yhteen miljoonaan jo yhdessä päivässä. Ja viiden päivän kuluttua- jos immuniteetti olisi vain adaptatiivisen immuniteetin ( humoraalisen ja soluvälitteisen puolustuksen)  varassa, bakteereita olisi  miltei ” googol” ( 10*E100) - satanollainen luku. Yksinkertainen totuus on, että ihminen ei pystyisi elämään mikrobimassan keskellä ilman muutakin immuunipuolustusta kuin soluvälitteistä täsmäjärjestelmää.

Luonnollisen (valmiina olevaisen) immuniteetin etu on nopeus ja monipuolinen valmius ja heikkous on epäspesifisyys

Luonnolliseen immuniteettiin kuuluukin sen takia käytännöllien todellinen barrikadi epiteelisoluja ja  fagosyyttejä, jotka tuottavat ”omia antibiootteja”, mikrobisidejä molekyylejä. Kudosepiteeli  on  jo mekaaninen este ulkopuolista maailmaa vastaan. Se tuottaa vahvoja effektorimolekyylejä. Jyväinen valkosolu kuuluu luonnolliseen immuniteettiin, nielee bakteereita ja käyttää antimikrobiaalisia molekyylejä bakteerin tuhoamiseen. Toisia antimikrobiaalisia molekyylejä myös eritetään. Luonnollinen immuniteetti ei ole niin täsmällinen kuin adaptatiivinen, joten  sen aktivoimiseen ei mene niin pitkää aikaa, se on ajallisesti joustava ja sen barrikadit ovat jo olemassa ennen kuin mitään on tapahtunutkaan.

Soluilla on PAMP-systeemit:

patogeeniin liittyvät molekulaariset käyttäytymismallit ja tien valinnat ( pathogen-associated molecular patterns).

Esim. TLR-reseptorit, (Toll-like receptors) ovat 11 jäseninen perhe ja tunnistaa PAMP, kuten proteoglygaaneja (TLR2),

kaksisäikeista RNA:ta ( TLR3),

LPS-rakennetta (TLR4),

flagelliinia (TLR5),

yksisäikeistä RNA:ta (TLR7)

ja bakteerin DNA:ta (TLR9)

Jos mikrobi lähestyy solua, jossa on näitä reseptoreja, alkaa signaalikaskadi, jossa on mukana MyD88- ja vaste on todennäköisesti  mikrobille spesifinen ja joskus käsittää antimikrobiaalisten peptidien indusoitumisen.Tavallisilla ja patogeenisilla bakteereilla on samoja rakenteita, mutta miten immuunisysteemi pystyy erottamaan normaaliflooraa ja patogeenia- sitä asiaa ei tunneta aivan yksityiskohtaisesti vieläkään-  laajat tutkimukset ovat menossa. Esim. suuontelossa on normaaliflooraa ja patogeeneja ja kummatkin säätävät antimikrobiaaleja peptideitä esiin- mutta eri signaaliteitä.

Mitä antimikrobiellit peptidit ovat?

Niitä on löydetty kaikista korkeammista eukaryoottisista organismeista. Mutta niitä esiintyy myös archea-, eubacteria-ja  protoplasma-lajeissa, kasveissa ja  selkärangattomilla, joten ne ovat olleet olemassa jo varhaisessa evoluutiossa mukana. Nisäkkäillä niitä on epiteelissä ja verisoluissa. Antimikrobiaalit peptidit ovat kooltaan alle 50 aminohapon pituisia, pystyvät suoraa tuhomaan bakteereita, sieniä ja vaipallisia viruksia. Jokaisella on aivan yksilöllinen aktiviteettispektrinsä ja yksikin muuntunut aminohappo vaikuttaa peptidin tehon muutoksen. Peptidit ovat tertiäärirakenteiltaan erilaisia. Mutta kaikille on yhteistä amfipaattinen rakenne.

Mitä tarkoittaa amfipaattinen rakenne?

(Kirja esittää kuvan  Edmundson wheel projection of the amphipathic alfa helix)

Edmundsonin  kuvaan on astettu  LL-37 peptidiä  ympyrän ( wheel)   avulla, toista puoliympyrää kiertää hydrofobiset aminohapot ja toista puoliympyrää  hydrofiilisten luettelo.

Täten ympyrän hydrofiilinen (vesiliukoinen )  puoli sisältää    K, K, E, (Q), K, D, R, K, R,E        (välissä on poikkeus Q, glutamiini)

K+( lysiini); K+(lysiini);  E-(glutamiinihappo),---, D- (aspartaatti), R+(arginiini); K+(lysiini);R+(Arginiini); E- ( Glutamiinihappo).

Ympyrän hydrofobinen (rasvaliukoinen) puoli sisältää G,V, L, F, I, I, I, F eli aromaattisia aminohappoa ( F, fenylalaniini); ja  haarallisia aminohappoja ( valiini, V; isoleusiini I)

 (sekä poikkeus, pienin rakenneaminohappo   glysiinin G).

Kaikenkaikkiaan näistä aminohapoista suurin osa on essentiellejä, ravinnosta riippuvia, kuten F, K,V, L, I). ( Kommentti: Tässä täytyy muistaa, että kaiken immunivasteen taustalla on hyvä ravitsemustila)

Mikä on antimikrobiellien peptidien toimintamekanismi?

Näistä suurin osa on membraaniaktiiveja ja hajoittavat kohdesolunsa hävittämällä sen kalvon, mikä on bakteerin Achilleen kantapää. Membraanin integriteetit tuhotaan   eri mekanismeilla.

Barrel - stave- pore model: Aktiivi peptidi kulkee membraania pitkin  asettaen hydrofobisen kohtansa  lipideihin ja hydrofiilisen kohtansa sinne, missä on aukkoja ja aiheuttaa täten kanavan, josta alkaa  veden  ja elektrolyyttien vuotoa.

Toroidal pore model:  Peptidit saostuvat ja kokoontuvat aiheuttaen lipidien kertamolekulaarisen kerroksen painautumista kalvoaukkoihin ja niin lipidipäädyt ohjautuvat vetiseen ytimeen päin ja membraani luhistuu porus-aukon muodostuttuessa.

Carpet model: Bakteerin pinta peitetään peptideillä ja elektrostaattisten intraktioitten avulla kalvo rikkoutuu kuten pintajännitystä poistavilla  detergenteillä.

Antimikrobiellien peptidien kohde on bakteerien pintakalvot. Bakteeri tuskin pystyy omaa pintakalvoaan enää muuttamaan tai korjamaan, joten vain harvoin bakteeri pystyy kehittämään resistenssiä antimikrobiellejä peptidejä kohtaan.

Korkeissa pitoisuuksissa kationiset antimikrobiellit bakterisidiset  peptidit (+) ovat sytotoksisia. Antimikrobielli peptidi  voittopuolisesti positiivisen rakenteensa takia on enemmän attrahoitunut bakteerikalvoihin (-)  kuin ihmisen omien solujen kalvoihin, jotka ovat neutraaleja. Bakteerien kalvojen ollessa negatiivisesti latautuneita ( anionisia). Tämä ero kalvojen varauksessa johtuu bakteerien ulomman kalvon suuremmasta happamien fosfolipidien pitoisuudesta, kun taas eukaryoottisissa organismeissa on kalvoissa enemmän kolesterolia ja zwitterjonisia fosfolipidejä  pinnoillaan extrasellulaaritilaan päin ja happamat fosfolipidit (-)  on sijoitettuna sytoplasmiselle puolelle.

Antimikrobiellit bakteerit harrastavat edelläkuvatun lyysi-järjestelmän lisäksi muitakin toiminnallisia mekanismeja. Proliinipitoiset ( P) antimikrobiellit peptidit estävät bakteerien kriittisiä intrasellulaarisia synteesiprosesseja

Histatiinit omaavat antifungaalisia mekanismeja kohteinaan bakteerien mitokondriat ja ne aiheuttavat ATP:n vuotamista pois niistä.

Mitä muuta antimikrobiellit peptidit voivat tehdä kuin suoraan tuhota mikrobia tai estää sen kasvua?

Ne toimivat kemoatraktantteina immuunijärjestelmän soluille, valkosoluille, monosyyteille ja imusoluille Näin nämä peptidit voivat toimia  välisiltana luonnollisen immuunipuolustuksen solujen ja adaptatiivisen immuunipuolustuksen solujen kesken.

Näillä peptideillä on myös immunomodulatorista ominaisuutta: ne lisäävät dendriittisolujen differentaatiota ja kiihdyttävät sen endosytoosikapasiteettia.

Ne saavat myös epiteelisolut ja makrofagit tehostamaan kemokiiniensä tuotoa

Niillä on niin paljon immunomodulatiivisia tehtäviä, että joku on kysynyt, onko niiden päätehtävä ollenkaan se bakteerien  tappaminen.

Ne voivat neutraloida LPS,  lisätä fagosytoosia, indusoida mast-solujen degranulaatiota ja osallistua komplementtisysteemin säätöön. Lisäksi ne stimuloivat angiogeneesiä ja haavojen uudelleen epitelisoitumista. Siis ne ovat multifunktionaalisia in vivo.

Ihmisen antimikrobiellit peptidit

Pääperheet ovat defensiinit ja cathelicidiinit.

Defensiineillä on kolme disulfidisiltaa. Cathelicidiineillä on konservoitunut pre-pro-alue.

Defensiinejä on alfa, beeta ja theta-defensiini

Alfadefensiinejä on neutrofiileissa. Niitä on kuusi jäsentä HNP 1-4 , (human neutrophil peptides 1-4 ) kiertävissä neutrofiileissä ja HD5,6 ( human defensin 5, 6)  Panethin soluissa ohuessa suolessa.

HNP 1-3 varastoituu neutrofiilien jyväsiin kypsinä peptideinä ja ne ovat täysin aktiiveja granuloitten fusoituessa fagolysosomeihin.Tätä esiintyy vernix-vahassa.

HD-5 varastoituu pro-proteiinina ja prosessoituu Panethin solun trypsiinillä.

Beetadefensiinejä on epiteelissä, ne tuottuvat pre-pro-proteiineina. Kypsät ovat 35-45- tähteisiä.

Niitä on löydetty neljä (HBD 1-4). Ihmisestä on löydetty 28 beeta-defensiinigeeniä.

Theetadefensiinit Kuusi theta-defensiinigeeniä on löydetty ihmisen genomista, mutta niissä on prematura stop-kodoni, joten ne ovat pseudogeenejä.

Yhden tällaisen defensiinin  mRNA on havaittu luuytimestä. Sen  synteettisen replikaation oletetettu  potentiaalinen  proteiinituote, retrosykliini,  suojaa HIV-infektiolta.

 Ainoa ihmisen cathelicidiini on LL-37.(  Tästä kertoo väitöskirja laajasti ja tarkasti)

Tätä esiintyy mm vernix-vahassa.

Muitakin antimikrobiellejä peptidejä esiintyy ihmisellä

Niitä on eristetty ja luonnehdittu.

Hepcidiini  /LEAP-1  eiintyy maksassa, mutta löydettiin ensin verestä ja virtsasta.

Dermicidiini  on 47-tähteinen peptidi, jota on hikirauhasissa.

Histatiinit  ovat histidiinipitoisisa antifungaalisia peptidejä, joita on syljessä.

Vernixvahan antimikrobiellit peptidit ovat runsaat, ainakin parikymmentä

 Eri defensiinejä, lysozyymiä,  ubiquitiiniä, psoriasiinia, SLP1 ( secretory leucocyte protease inhibitor),  laktoferriiniä,  cystatiini A ( proteaai-inhibiittori cysteiiniproteaaseja kohtaan), calprotektiinit, (calgranuliini A ja B ovat on antifungaalisia ;  calgranuliini C on  antihelmentica vaikutteinen), UGRP-1 ( opsoniinin tapainen proteiini). Vernixin antimikrobiellit lipidit(3) oat interaktiosa  cathelicidiiniin, laktoferiiniin ja lysozymiin.

KOMMENTTI

Väitöskirja on kaikeinkaikkiaan  toiveita herättävä tällaisena aikana kun resistenssi miltei lääkkeelle kuin lääkkeelle on kehittymässä ja jopa muuntaa geenistöä.

Kaikkea kehon omaa puolustusjärjestelmää  kohentavaa kannattaa korostaa, mutta siitä täytyy ensin tietää ja siinä tiedonannossa tällä väitöskirjalla on erinomainen  asemansa.

Siksi otin esiin suomennokseen abstraktin lisäksi hieman  taustatietoa. Näyttää olevan, että funktionaaliset kohdat ovat suurimmaksi osaksi essentielleistä aminohapoista kehkeytyneet ainakin  kirjan kuvaamassa antimikrobiellissä  edustajapeptidissä.

Ravitsemuksen tarkistaminen, ihon ja limakalvojen hyvä hoito ennen influenssan ym epidemioitten aikoja on edullista. Proteiinilisää ei koskaan tarpeeksi painoteta, onhan kaikki regeneratiiviset ja immunologiset tekijät lähinnä syntetisoituvia proteiineja ja peptidejä.

D-vitamiinin ja muiden antioksidanttien osuutta kyllä nykyisin jo  hoidetaankin.

Tietyt proteiinilaadut ( haaralliset aminohapot) saadaan  hyvin kalaravinnosta ja palkokaseista.

Kasvisperäisestä  proteiinivariaatiosta  saa paljon aromaattisia aminohappoja ja  glutamiinia (Q) saa varsinkin viljasta ja sehän on immunomodulatiivinen ja typpeä antava.  Kombinoidut proteiinit kattavat parhaiten proteiinintarpeen. -( siis ei mikään yksittäinen valkuaislaatu tai yksittäinen aminohappo). Luonnollisesti lihaproteiini sisältää paljon sitä, mitä keho itsekin syntetisoi, joten liha antaa erilaisia keholle tärkeitä monimutkaisempia valmismolekyylejä (karnitiini, arginiini, B-vitamiineja, histidiinilajit, syklien välituotteita, valmiita  hiiliketjurunkoja., vitamiini- ja mineraalijärjestelmien  proteiineja ).

2005-11-09 15:14. Päivitys 23.11. 2014