(2) jatkuu: Yksityiskohtia stafylokokin proteaasien arsenaalista

Väitöskirja vuodelta 2007: hdl.handle.net/2077/2584 LÄHDE: Ann-Marie Calander. Proteases in Staphylococcal Arthritis. Dep. of Rheumatology and inflammation Research. Sahlgrenska Academy, Göteborg university. ISBN 978-91-628-7040-9

Yksityiskohtien suomennosta: 

• S.aureus käyttää extrasellulaarisia proteiineja vähentämään alttiuttaan isäntäkehon antimikrobisille peptideille.

Todellakin aureolysiinin erittyminen korreloi hyvi LL-37 hajoamisen monitorointiin massaspektrometrisissä analyyseissä. S. Aureuksella on kuvattu olevan 19 erilaista superantigeeniä (SAgs). Superantigeenit pystyvät ohittamaan konventionellin antigeenin tunnistamis järjestelmän linkkiytymällä suoraan MHCII molekyylikompleksin APC soluissa ja tiettyyn Vbeeta-perheeseen T-solureseptorissa. Tämä johtaa T-solujen massiiviseen proliferoitumiseen ja sytokiinien vapautumiseen, mikä voi päätyä toksisen shokin oireyhtymään (TSS) . Viime kädessä isäntäkehon puolustusarsenaalin keinokkuuden ja kehoon tunkeutujan kapasiteetin paremmuuden välisessa tasapainossa selviää, tuleeko ilmiselvä infektio vai ei

S. aureus uses extracellular proteases to decrease its susceptibility to host antimicrobial peptide LL-37.

Indeed, the secretion of aureolysin correlated well with the rate of LL-37 degradation monitored by mass spectroscopy analysis [57]. In S. aureus, 19 different superantigens (SAgs) have been described.

SAgs bypass conventional antigen recognition by directly cross-linking major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules on antigen-presenting cells with certain Vβfamilies within T cell receptors. This leads to massive T cell proliferation and cytokine release, which may end up in toxic shock syndrome [58]. Ultimately the balance between the host arsenal of defence measures and the invaders’ capacity to surpass them will decide whether the result will be an overt infection or not.

• Stafylokokin extrasellulaariset proteaasit

Joukko stafylokokin proteaaseja on kuvattu tähän mennessä. Bakteeri on hyvin varustautunut. 

 Bakteerin kromosomissa on neljä eri operonia, joiden mukaan koodautuneet proteaasit luetteloidaan lyhennyksellä- eikä niinkään niiden funktion mukaisesti, mikä taas tulee esiin niiden pidemmistä nimistä, joten nimeäminen oon jonkin verran hämäävä..

Extrasellulaariset proteaasigeenien bakteerikromosomissa sijaitsevat ovat neljä eri operonia ovat:

Stafylokokin seriiniproteaasi-operoni, Staphylococcal serine protease (Ssp) operon

Stafylokokin seriiniproteaasin kaltainen operoni, Staphylococcal serine protease like (spl) operon

Stafylokokin cysteiiniproteaasioperoni, Staphylococcal cysteine protease(scp) operon

Aureolysiinioperoni. Aureolysin (aur) operon

Täten V8 proteaasi (SAspA) ja stafopaiini B( SspB) on molemmat nimetty sen operonin mukaan, josta ne koodautuvat (Ssp), vaikka vain SspA on seriiniproteaasi kun taas SspB on kysteiiniproteaasi.

Staphylococcal extracellular proteases

Until today a handful of extracellular proteases from S. aureus have been described. Their short denominations emanate from the operon by which they are encoded and not from their function as do their longer names which makes the nomenclature somewhat confusing.

The genes of extracellular proteases are organized on the bacterial chromosome into four distinct operons:

staphylococcal serine protease (ssp) operon,

serine protease like proteins (spl) operon,

staphylococcal cysteine protease (scp) operon,

and aureolysin (aur) operon.

Thus the V8 protease (SspA) and staphopain B (SspB) both are named by their encoding ssp operon although only SspA is a serine protease whilst SspB is a cysteine protease

• Seriiniproteaasi V8 (Ssp A)

V8 proteaasi saatin puhdistettua S- aureuskannasta V8 vuonna 1972( Draopean et al). He havaitsivat, että V8 proteaasi pilkkoo C-terminaalisen aspartaatin (D, Asp) tai glutamiinihapon (E, Glu) peptidisillan . Sentakia sitä on voitu käyttää ratkaistaessa proteiinien primäärirakenneta, peptidien sekvenssiä.

Tässä proteaasissa ei ole yhtään rikkisiltoa eikä sillä ole paljoakaan sekvenssien samankaltaisuutta muitten seriiniproteiinien kanssa. Mutta sen sijaan sen tertiäärinen rakenne omaa merkittävää struktuurihomologiaa esim. stafylokokin epidermolyyttisten toksiinien A ja B kanssa.

Serine protease V8 (SspA)

V8 protease was first purifiedfrom culture filtrate of S. aureus,strain V8 by Drapeau et al in 1972. Their studies revealed that V8 protease exclusively cleaves peptide bonds on the carboxyl-terminal side of either aspartic acid or glutamic acid [60]. Since then V8 protease has been widely used for determining the primary structures of proteins. The V8 protease does not have a high degree of sequence identity with other serine proteases and does not contain any disulphide bridges, but it’s tertiary structure was found to have significant structure homology with, for example the staphylococci epidermolytic toxins A and B .

• Metalloproteaasi AUREOLYSIINI  (aur)

Aureolysiinin primäärinen ja tertiäärinen rakenne on selvitetty. Seon rakenteeltaan polypeptidiketju, jossa on 301 aminohappoa. Proteiini on laskostunut N-terminaalidomaanissa on beetatuppirakenteella ja C-terminaalissa on alfa-helix.domaanilla. Sellainen rakenne on tyypillinen metalloproteinaasien termolysiiniperheelle. 

Bakteerien metalloproteinaasien sekalaiseen perheeseen kuuluu monia entsyymeitä, tunnettuja virulenssitekijöitä mm.

Pseudomonas aeruginosan elastaasi,

Legionella pneumophilan metalloproteinaasi

Listeria monocytogenes-mikrobin metalloproteinaasi

Vibrio cholerae -bakteerin hemagglutiniini proteaasi

Staphylococcus epidermidiksen elastaasi

Chlostridium perfringes -bakteerin lambda-toksiini.

Päinvastoin kuin näistä luetelluista proteinaaseista niin S. aureuksen aureolysiinin merkityksestä ja tarkasta tehtävästä patogeneesissä ei tiedetä niin paljon.

Koeputkessa aureolysiini pilkkoo plasmaproteinaasin inhibiittoreita: alfa1-antikymotrypsiiniä ja alfa1-proteinaasin inhibiittoria. 

Aureolysiini pilkkoo plasman alfa1-proteinaasi-inhibiittorin oksidoitua muotoa nopeammin kuin inhibiittorin natiivia muotoa. Tästä voisi olettaa, että sellaiset bakteerit, jotka tuottavat metalloproteinaaseja ,saavat vain etua isäntäkehon oksidatiivisesta (happimolekyyliä käyttävästä) puolustusstrategiasta, jolloin samalla alfa1-proteinaasi-inhibiittorin eliminominen kiihtyy ja siitä taas on seurauksena, että kudosten hajoaminen neutrofiilien elastaasin vaikutuksesta lisääntyy .

Aureolysiinigeenin rakenne on hyvin konservoitu S-aureuskannoissa. Se puoltaisi todennäköisyyttä, että enzyymillä lienee tärkeä funktio bakteerin taloudenhoidossa.

Metalloprotease aureolysin (Aur)

The primary and tertiary structures of aureolysin have been determined revealing a polypeptide chain of 301 amino acids which is folded into a β-pleated N-terminal domain and an α-helical C-terminal domain, a typical fold for the thermolysin family of metalloproteinases [62]. The diverse family of bacterial metalloproteinases encompasses several enzymes, which are acknowledged virulence factors, including Pseudomonas aeruginosa elastase,

Legionella pneumophila and Listeria monocytogenes metalloproteinases,

Vibrio cholerae hemagglutinin protease, Staphylococcus epidermidis elastase,

and the lambda toxin of Clostridium perfringens.

In contrast to these proteinases, however, little is known about the exact role of aureolysin in the pathogenicity of S. aureus.

In vitro, aureolysin has been shown to cleave the plasma proteinase inhibitors, α1-antichymo-trypsin and α1-proteinase inhibitor.

Aureolysin cleaves the oxidized form of α1-proteinase inhibitor faster than it cleaves the native inhibitor, suggesting that bacteria which secrete these metalloproteinases may specifically take advantage of the host defense oxidative mechanism to accelerate elimination of α1- proteinase inhibitor and consequently increase tissue degradation by neutrophil elastase[63].

The structure of the aureolysin gene is strongly conserved among S. aureus strains. This argues in favor of the likelihood that the enzyme may have an important house keeping function [64].

• S.Aureuksen cysteiiniproteaasit STAFOPAIINI  B (Ssp B)
   ja STAFOPAIINI A (Scp A).

Kysteiiniproteiineilla on papaiinin kaltaisia piirteitä, ja voimakas elastinolyyttinen aktiivisuus, millä katsotaan olevan merkitystä bakteerin leviämisesä kudoksissa ja abskessien (paiseitten) muodostuksessa. Kiniiniä vapauttavia kysteiiniproteinaaseja on raportoitu useilta mikrobeilta.

S.aureuksesta peräisin oleva stafopaiini A, (Scp A) kehkeyttää ihmisplasmasta jo submikromolaarisessa pitoisuudessa esiin suuria kiniinimääriä viidessä minuutissa altistuksesta. Vastaavassa koe-eläinmallissa marsulla ScpA- ja Ssp B- stafopaiinit aiheuttivat verisuonten läpivuotoa ja verenpaineen madaltumista. Täten stafopaiinien välittämän verisuonten seinien läpitihkumisen oletettiin olevan turvotusten (oedema) muodostumisessa osallisena tulehduskohdassa kuten myös septisen shokin indusoitumisessa

Cysteine proteases Staphopain B (SspB) and Staphopain A (ScpA)

The cysteine proteases exhibit, with their papain like features, potent elastinolytic activity which has been considered to be of importance for bacterial spread within tissues and also for the forming of abscesses [65]. Kinin-releasing cysteine proteinases have been reported from various microbes. From S. aureus a submicromolar concentration of ScpA generated large amounts of kinin from human plasma within 5 minutes from exposure and in a guinea pig experimental model, ScpA in concert with SspB induced vascular leakage and lowering of blood pressure. Thus staphopain mediated vascular leakage was proposed to be involved in the oedema formation at the infected sites as well as in the induction of septic shock [66]

• S.aureuksen extrasellulaaristen proteaasien geenisäätely, agr ja sarA  säätelijöillä

Useimpien extrasellulaaristen proteaasien geenien transkription havaittiin olevan maksimaalista juuri exponentiaalisen kasvun jälkeisessä vaiheessa, joten geeni säätyy positiivisesti lisägeenin säätelijällä (accesory gene regulator, agr) ja negatiivisesti stafylokokin apusäätelijällä ( staphylococcal accessory regulator, sarA).

Entsyymit erittyvät zymogeeneinä. Jokaisen proteaasin geenin mutaatioita käyttämällä on analysoitu proteolyyttisen kaskadin aktivoitumista

Aureolysiini katalysoi SspA zymogeenin aktivaatiota, vaikka se ei ole ainoa aines, joka pystyy tähän prosessiin

Aktivoitu Ssp A aktivoi puolestaan Ssp B-proentsyymin.

Aureolysiini ei voi autokatalysoitua aktivoituakseen, joten vielä ei ole osoitettu varmuudella, mikä triggeröi alkuun extrasellulaaristen entsyymien aktivaation. .

Kaiken lisäksi proteaasien aktivaation säätely on jo bakteerin sisässä kontrollinalaista.

Stafostatiini C (Ssp C) on inhibiittori Ssp B:lle ja suojaa intrasellulaarisia proteiineja proteolyyttistä vauriota vastaan, mitä voi tulla liian varhain aktivoituneesta stafopaiini B:stä.

Regulation of S. Aureus extracellular proteases

The transcription of most of the extracellular protease genes occurs maximally at post-exponential-phase, being positively regulated by the accessory gene

regulator (agr) and negatively regulated by the staphylococcal accessory regulator (sarA). The enzymes are excreted as zymogens. Using mutations in

each protease gene the proteolytic cascade of activation has been analyzed. Aureolysin catalyzes the activation of the SspA zymogen although it is not the sole agent capable of conducting this process.

Activated SspA in turn activates the SspB pro-enzyme [59]. Aureolysin has not been shown to be capable to undergo auto-proteolysis to achieve activation. Thus it is still not proven what triggers the start of the activation of the extracellular enzymes.

The regulation of protease activity is also under control already within the bacteria. Staphostatin C (SspC), the inhibitor of SspB, protects intracellular proteins against proteolytic damage by prematurely activated Staphopain B [67].

Suomennoksia  27.11. 2014